桃仁，苦桂花树的分子鉴定已经成立并根据其网站上的特异性基于PCR的识别方法已经建立。法：钓鱼，苦芦荟样品使用通用引物的基因组DNA进行测序的提取，通过BIOEDIT软件ITS序列比对，根据特定的设计特异性PCR反应对位点鉴定引物和PCR反应条件进行了优化。果：根据设计特异性地鉴定G47被用于识别和研究螺母芦荟苦其序列的引物，所述的位点特异性的条件通过PCR反应研究，将反应体系的25微升，将适当量在005〜1ng的范围内DNA模板，退火特异性是最佳在59℃的温度和实验方法是普遍用于不同的DNA聚合酶和PCR机器。论：PCR反应引物具体到研究现场的333 bp的桃仁条件的设计可以扩增条带清晰，苦桂花树但不带，允许快速和准确地识别芦荟苦坚果。键词桃，苦芦荟，性传播疾病，位点特异性PCR，分子鉴定识别蚜精液和精子根据其SequencesGao Linhui1，艳2尹力佳1马特定等位基因的Armeniacae amarum PCR扩增Yuemeng1，Wenbin1锂，李Bowen1，张Xianan1AbstractTo识别使用DNA分子识别和建立古典PCR鉴定mesthod.The的核核糖体DNA的内转录间隔区（ITS）桃蚜amarum精液双向序列通过BioEdit.Specific识别的引物进行分析物扩增amarum桃仁和Armeniacae精液和sequenced.ITS分别根据其特定的等位基因的序列设计，以及PCR反应体系进行了优化。液和桃仁Armeniacae amarum可以通过peimers specfic G47取决于sequences.In的其浓度来identificated的条件是0051纳克每PCR反应℃之间25的最佳退火温度是微升59°被用于不同类型的DNA聚合酶的这种方法。ymerases并导致instruments.The不同PCR表明，识别带333 bp的可以在精液被放大桃蚜，那么它就不能在amarum.It Armeniacae精液进行扩增确认了放大系统特定等位基因的PCR可用于鉴定苦杏仁蚜精液和精子Armeniacae amarum快速度和accurately.Key WordsPersicae精液; SA; PCR扩增特异性等位基因，CTC分子鉴定：R284; R917文献代码：ADOI：10.3969 / .09.050 j.issn.1673-7202.2017钓蔷薇科桃（L）Batsch或山桃Pdavidiana（卡尔）獐干燥成熟种子，性质，苦味，甜味，心脏，肝脏，大肠，与淤滞，泻药，止咳平喘，
桂花树闭经痛经，骨盆大量片，阑尾炎肺脓肿，或扑病变，干便秘，咳嗽，哮喘[1 ]。桂花树属于蔷薇科的植物野生杏Parmeniaca Lvaransu马克西姆Psibirica杏西伯利亚大号东北Pmandshurica杏（马克西姆）海棠或杏Parmeniaca将干燥成熟种子，温暖，苦，肺，大肠，为咳嗽较低的气体哮喘，泻药，咳喘的效果，胸部粘液，肠燥便秘[1]。荟苦，在外观上非常相似桃子去皮，用治疗更难以区分对待，但是，两者有很大的不同的药理作用，药品流通领域属于坚果，止咳平喘药芦荟。种化合物的主要化学成分都是苦味皂苷，传统鉴别方法的应用容易出错。外，芦荟苦芦荟苦超过芥子油苷含量，之后，化合物分解苦桂花树酶代谢以产生有毒的氰化氢过量引起中毒，苦芦荟和螺母组合，易引起潜在的药物风险[2]。此，建立快速鉴定，简便，准确的分子识别系统桃花石木苦琼脂是非常重要的核心捕鱼的质量控制和药物安全。实验进行了ITS用于PCR特定于站点和芦荟苦坚果识别药用的样品，的特异性PCR引物和反应条件的具体设计的标识序列的基础上进行了探索和优化方法确定鉴定实验稳定，快速，如坚果提供准确鉴定苦味和桂花树的基础。料与方法捕捞样品和苦桂花树来源样本：河北安国从亳州市在中国医药市场安徽和药材市场购买，李家福教授的医疗资本大学医学院识别（ID：1，2，10，11，12，19）从山西，河北，北京，垂钓，山地渔，样品刘春生教授苦桂花树标识（ID大学收集北京中国医学认为：8，9，18，24，25，26），国家中心提供的桃核和木材苦琼脂的样品中国药材资源的传统调查（N°： 3，4，5，6，7，13，14，15，16，17，20，21，22，23），在样品上信息示于表1的标准医药物质桃仁（善导，T号）和苦杏仁（杏，X号）的标准药用物质购自靠近中国食品药品检验研究院。NCBI下载序列示于表2仪器PCR仪（Applied Biosystems公司Veriti;的Eppendorf AG 22331）仪器定量micronucléique酸（纳米滴200℃），化学发光系统高级荧光（FUSIONSL）。剂植物基因组DNA提取试剂盒（DP3052离心柱，TIANGEN）; 2×EasyTaq PCR SuperMix（AS111，TRANS）; 2×Taq Starmix PCR（A112，GENSTAR）; Ex Taq DNA聚合酶（RR53AM，Takara）; Phusion Master Mix超保真PCR（M0531，BioLab）; 2K DNA标记（E110，TransGen）。因组DNA，PCR扩增和测序的约100毫克样品的通用引物，在研磨后，总DNA的各种药用植物的提取试剂盒，基因组DNA的提取最后用50μl无菌水洗脱。品使用使用通用引物ITS [3]（参见序列表1）高保真酶扩增，并进行双向测序。PCR扩增系统由主的PCR混合的Phusion超保真125微升，正和负引物075微升，DNA的2微升，无菌水和25微升的总系统9微升。PCR扩增程序呈现在表3中的PCR产物由北京测序部门瑞博兴科生物技术有限公司测序每个样品在两个方向上测序以确保准确的结果。序结果与网上坚果和使用CLUSTAL X软件的苦涩芦荟序列的序列比对，构建使用MEGA6连续性分组树法（NJ），引导系统的序列分析（ 1000个复制）测试每个分支的支持。体鉴定引物序列测定的设计是相对于ITS由BIOEDIT软件桃仁，苦桂花树GenBank中的序列来找到稳定的差异特异性片段，以及网站突变被筛选并通过该网站。物对一些使用该软件专为桃仁的特定片段底漆总理50和总结了芮般行生物技术有限公司PCR引物在特异性筛选通过PCR使用设计的引物进行，PCR中使用的反应体系的25微升如下：2×EasyTaq PCR超级混合125微升，呈阳性引物各05微升和负，将DNA稀释20倍为1点PL，无菌水填充用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。果清楚，清晰的条带为阳性，其他为阴性，从而确定引物的特异性。PCR的反应条件已为的最佳位点特异性PCR优化反应条件的条件特别优化进行了研究DNA模板浓度（0005纳克/升，001纳克/升，002毫微克/微升，005纳克/微升，01毫微克/微升，02纳克/升，025毫微克/微升，05纳克/升，1毫微克/ PL，2纳克/微升），退火温度（55℃，57℃，59℃，61 ℃，63℃），型聚合酶（实施例Taq DNA聚合酶，2×PCR的Taq STARMIX，2×PCR超混合液EasyTaq），不同的PCR仪（Applied Biosystems公司Veriti;在所述PCR反应的Eppendorf AG 22331）的效果。反应体系如下：125微升DNA聚合酶，正和负的引物各05微升，DNA 1微升和无菌水25微升。般结果与分析引物的电泳结果的样本扩增通用引物ITS的PCR扩增成功率为100％，也就是说，所有的有明亮，清晰的条带。增的结果示于图1中示出基于该钓鱼的系统采样ITS苦桂花树序列使用该方法米加6结构苦桂花树钓鱼和系统发生树构建进化系统树分析软件，使用基台（NJ）系统发育。见图2，使用该系统树的每个分支的距离Kimura2parameter信任由引导方法总共1 000次检查。图2所示，桃样品与标准药物进化枝钓鱼，芦荟苦与进化枝的标准药物苦味芦荟，显示其分子的标识序列钓鱼SES苦芦荟并具有理论基础。
特异性引物钓鱼香味DNA模板的PCR扩增提取并使用引物选择G47特异性PCR（参见序列表3）的苦味进行扩增。图所示，标准成分和螺母特定钓鱼扩增用样品3是正的，线条清晰，清晰明亮，333 bp和药用和芦荟苦芦荟苦特异性扩增样品的标准结果为阴性的大小，经证实该引物具有良好的特异性。增反应PCR.Les结果的条件下检查模板DNA在25微升的PCR反应体系的量在图4中示出的伪阳性条带出现在木材苦味琼脂，DNA模板浓度为2 ng /μL。002毫微克/微升时螺母不清晰，明亮的带，并且引物二聚体显著增加（见图4），从而确定DNA模板本发明方法的浓度应适宜在005~1 ng / ul范围内。用005ng /μL的DNA模板浓度，在其他条件下继续实验。退火温度设定在55℃，57℃，59℃，61℃和63℃，并且将结果示于图5.结果可以看出，这两个鱼看起来干净，清晰的条带，并且条带不苦芦荟，对后者的退火温度没有影响，因为该方法使用59 ]°。
.退火温度聚合酶的DNA聚合酶实施例的Taq DNA调查，2×PCR的Taq STARMIX，2×PCR超混合液EasyTaq 3个聚合酶检查。结果如图6所示。用各种聚合酶的PCR反应都在伪产品和333个碱基对真实特异扩增带中没有带表明特异的引物可以用各种酶，而不进行测试没有限制。两个不同的PCR仪的PCR仪器的重复选择的实验结果的影响（艾本德公司22331，Applied Biosystems公司Veriti）检查结果是钓鱼出现整齐的乐队，没有带显示效果清晰明亮，芦荟苦（图7），这表明该方法具有良好的稳定性和高的可重复性，并且在PCR仪对结果没有显著效果。论由于钓鱼物种复杂，大形态变异，苦芦荟和类似形式，尤其是山钓鱼香和更难以区分形态，所以难以准确地识别它们之间的差的传统在实际应用中。位点特异性PCR引物具有以下优点：操作简单，成本低，重复性好等。
用特异性引物可大大降低误报CRP水平，并确保准确的鉴定结果[4]，特别是快速PCR技术在近几年。速发展使得中药在该领域的分子鉴定成为可能[56]。华等人[7]证实肉苁蓉可以获得掺杂物的快速和准确的鉴定肉苁蓉此目的通过位点的特异性PCR方法扩增的331个碱基对，而不是掺杂物带。
康等。[8]具有改善的利用PCR法使用特定于站点的引物的实验条件和应用快速PCR方法来区分真正的蛇显示荧光。
立了用于蛇可以是30〜45分钟以完成医药物质快速PCR的检测方法。着等人[9]和医学麦冬rDNAITS搀杂片段进行比较分析，应用程序特定的引物的PCR方法是太子参药物和搀杂良好的区分。DNA条形码技术在物种的鉴定和分类中发挥着越来越重要的作用[1012]。
物的识别序列被用于ITS序列，包括ITSL，ITS2，58S〜26S rDNA的，分别187〜298个碱基，和长度之间位于18S〜58S rDNA的187〜252碱基对，和18S， 58S，26S rDNA序列和高度保守，其通用引物适用于多种物种[13]。Chen等人[3]相比，药用植物DNA条形码7个候选（psbAtrnH，rbcL基因，matK序列，rpoC1，ycf5，ITS2和ITS），ITS2和测试753物种鉴定种4800 6600采样率成功导致了在物种水平927％的识别成功率，ITS2终于被认为是DNA条形码药用植物广泛认可。汉林及其同事发现了分子的药用物质桃仁及其物种apparentées.Les结果表明，ITS2序列能够有效识别钓鱼的条形码形式核心及其近缘种DNA。个实验序列最初选择钓鱼和苦药用芦荟测序ITS2，但由于它们的亲缘关系较近，大的序列相似性，并且是非常不同的一个基础，是很难设计好度特定引物的区分。
国工厂条形码工作组[14]上的rbcL 42目75种科6286种植物样品141种和757个物种matK序列，psbAtrnH，ITS序列进行了研究。果表明，其具有识别，建议STI / ITS2应该是种子植物的主条形码的最大能力。此，本研究中，即，钓鱼苦菜和香ITS序列进行测序，两种药材其对多晶硅结构序列，没有突变的更严重，所有草药顺序在与成功，但根据测序结果和与对齐的线分析的顺序进行和具体的鉴定引物conçues.Les结果表明，引物具有良好的特异性和电源辨别高，可作为鉴定桃仁和苦杏仁的特异性引物。些筛选实验，并通过特异性引物优化的条件下，确定最后25微升PCR反应体系中，在DNA模板范围的样品体积中的G47引物005纳克〜1，退火温度可以是用55~63℃的有效芦荟捕捞有效鉴别。方法具有灵敏度高，稳定性好，可用于桃核和苦木琼脂分子鉴定，以及用于促进和桃仁的分子识别应用。也是快速确定渔业核心的参考。
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